До недавнего времени сведения о роли микроорганизмов в поддержании здоровья человека, хоть и отличались большой массивностью, не были «упакованы» в стройную логическую систему; при этом хотя бы примерное количество и систематика населяющих человека симбионтов оставались неясными. Было известно лишь то, что безмикробные животные (гнотобионты) отстают в физическом развитии и умирают раньше своих сородичей, выращенных в обычных условиях — слишком много функций взяли на себя в процессе эволюции «бактерии-пассажиры». Чтобы устранить этот огромный пробел, в 2007 году Национальный институт здоровья США (National Institutes of Health [NIH], USA) запустил 5-летний проект «Микробиом человека» (Human Microbiom Project). Его целью стало определение всего видового и количественного состава микробиоты здорового человека путём  анализа последовательности ДНК этих микроорганизмов. Полученную генетическую информацию в дальнейшем планировалось использовать в том числе для выяснения того, кáк отсутствие и наличие тех или иных микроорганизмов связано со здоровьем человека и возникновением заболеваний. Осознавая особую общенаучную ценность изучаемых сведений, фонд не только обеспечил открытый доступ к полученным данным в режиме реального времени, но также регулярно публиковал результаты исследований2,3. Первый этап работы завершили к лету 2012 года, и уже 14 июня в Nature и серии журналов Public Library of Science появилось около 15 статей, представивших итоги. Проект объединил около 200 ученых из 80 мультидисциплинарных исследовательских институтов и обошёлся NIH в $173 млн. Событие поистине историческое: мобилизовав возможности и объединившись в международную исследовательскую группу, учёным удалось приподняться над известным ранее и увидеть новый горизонт, картину в целом. Только на протяжении 2012– 2013 годов опубликовано более 250 интереснейших статей, посвящённых микробиому человека. Это ли не проявление высочайшего интереса научного сообщества к проблеме? Свой кусочек «славы» достался в проекте «Микробиом человека» и вагинальной микроэкологии.

Микробиом — общее количество генов всех бактерий, населяющих человеческий организм, — по объёму генетической информации значительно превышает объём, закодированный в геноме самого человека, однако до определённого времени этот факт не рассматривали в качестве детерминанты здоровья или болезней. Микробиоту человека слишком долго изучали лишь с целью подавления и ликвидации патогенов, и лишь в наши дни можно сказать, что парадигма «убей врага!» сменяется гораздо более продуманной «восстанови биоценоз!». Важно осознавать, что микросимбионты составляют около 90%  от общего числа клеток организма, и только оставшиеся 10% — собственно клетки человека4 . Эта информация кардинальным образом меняет современные представления о роли бактерий в нашей жизни, и сегодня организм человека в совокупности с населяющими его (и тесно с ним контактирующими) микроорганизмами принято называть суперорганизмом. Аналогия с мультяшными «супергероями» здесь срабатывает полностью: суперорганизм, единое целое из человека и его микробиома, комплексно реагирует на внешние и внутренние раздражители и аналогичным образом эволюционирует. Демонизация микробов в век антибиотиков и противомикробных препаратов оказалась напрасной и даже вредной, а значительная часть бывших «врагов» оказались не просто необходимыми для выживания, но и признаны важным резервом для эволюции вида. Не злодеи, а суперсила!

Ещё раз повторимся: собственных клеток в организме здорового человека примерно в 10 раз меньше, чем численность микроорганизмов, его населяющих5 . Возможно, причина в том, что клетки прокариот* намного меньше эукариотических клеток организма человека. Но не в десять же раз! Как бы то ни было, бактериальная доля в симбиозе «макроорганизм и его микрофлора» впечатляет воображение — совсем как необъятность звёздного неба августовской ночью. В человеческом теле симбиотические микробы живут буквально всюду: на коже и слизистых оболочках — в носу, в ротовой полости, в пищеварительном тракте, в мочевых путях и, конечно, в вульвовагинальном локусе. Многие из микробов выполняют важные функции, невосполнимые ферментами самого человеческого организма, например, переваривают растительную клетчатку, синтезируют витамины и незаменимые аминокислоты, участвуют в работе факторов местного иммунитета.

Чтобы получить представление о структуре нормального человеческого микробиома, исследователи собрали образцы тканей из 15 мест на теле 129 мужчин и из 18 мест — у 113 женщин. Все добровольцы были предварительно обследованы и признаны здоровыми; это взрослые люди в возрасте от 18 до 40 лет, живущие в Хьюстоне и Сент-Луисе. У каждого из них исследователи брали по три образца со слизистой оболочки с внутренней стороны щеки, носа, с кожи за ухом и с локтевого сгиба, а также фекальные образцы и образцы вагинальной жидкости у женщин. По результатам генетического анализа собранного материала было установлено, что в организме человека обитает более 10 тыс. видов различных микробов. Имен но они обеспечивают жизнедеятельность человека большей частью генетической, а следовательно, белковой информации: микробиом привносит в тело человека около 8 млн уникальных кодирующих генов. Иными словами, бактериальных генов в человеке в 360 раз больше, чем собственно человеческих! В целом же проект «Микробиом человека» был призван решить следующие задачи.

• Исследовать микробные геномы и предварительные характеристики микробиома человека.

• Изучить межвидовые взаимодействия в микробиоме человека, а также связи между изменениями микробиома и развитием заболеваний.

• Разработать новые инструменты и технологии для компьютерного анализа.

• Создать центр анализа и координации данных.

• Организовать хранилища данных.

• Спрогнозировать этические, правовые и социальные последствия проекта.

• Оценить данные о роли самого человека в микробиоме.

Перечисленные глобальные цели исследователи разделили на частные темы и распределили между собой. Так, например, иммунолог Флоридского университета в Гейнсвилле Кристиан Джобин (Christian Jobin) изучает взаимосвязь между воспалительными болезнями кишечника (болезнь Крона, неспецифический язвенный колит и др.), раком кишечника и кишечной микрофлорой. «…Микробиом ещё так мало изучен, — говорит он, — мы в некоторой растерянности; не знаем, чему отдать предпочтение сначала». Масштабность открывшейся учёным картины микробиомного взаимодействия настолько захватывает, что для многих становится соблазном как «вещь в себе»: некоторые участники проекта слишком увлекались изучением многообразия микроорганизмов и их систематизацией, это стало для них самоцелью. В то же время до сих пор не решены гораздо более важные проблемы, затрудняющие продолжение работы в рамках проекта. Роб Найт (Rob Knight), эколог-микробиолог из университета Колорадо (Боулдер-Сити), называет три из них.

Недостаточно строго унифицированы условия забора микробного материала. К примеру, через какое время после принятия душа можно брать пробу кожи? Какую диету должен соблюдать исследуемый накануне взятия анализа кала? Хотя учёные, собиравшие пробы у здоровых лиц, пытались соблюдать некие стандарты, часть из этих условий всё же не были приняты во внимание. Например часть микробиомных образцов оказались взятыми у людей, страдающих тем или иным заболеванием, и отличаются от нормы.

Для того чтобы секвенировать и проанализировать ДНК тысяч микробных видов, обитающих в человеке и на нём, нужна универсальная междисциплинарная команда учёных, обладающих знаниями по медицинской этике, биоинформатике и проектированию, а собрать такой коллектив — непростая задача.

До сих пор не ясно, изменение микробиома — причина заболевания или его следствие? Роб Найт считает, что эту задачу можно было бы решить, если исследовать микробиом некоторого количества лиц до, во время и после перенесённого заболевания. Эта информация позволила бы оценить риск развития патологических состояний, например ожирения10. Попутно анализ роли микробиома в развитии болезней может стимулировать разработку соответствующих лечебных препаратов и принципиальные изменения в схемах патогенетического лечения.

«…Если вы желаете избавиться от какой-то бактерии, фармацевтические компании предоставят вам тысячи препаратов. Воздействовать на болезнетворные гены и радикально избавить пациента именно от них — задача куда более сложная», — заключает Роб Найт. При этом понимание того, что значительный массив генетической информации, регулирующей жизнедеятельность человека, «заёмный», то есть принадлежит микроорганизмам, и в теории может быть скорригирован, открывает поистине головокружительные перспективы как для исследовательской работы, так и для терапевтического потенциала. Например, буквально в ноябре 2013 года как прямое следствие проекта «Микробиом человека» научный мир облетело сенсационное сообщение о том, что определённый вид кишечных бифидобактерий действенно устранял проявления аутизма (!) у детей за счёт восстановления проницаемости кишечной стенки5 .

От метода к результату Сам по себе проект «Микробиом человека» стал возможным благодаря научному развитию методов изучения бактерий. О присутствии микроорганизмов в окружающей среде и об их влиянии на здоровье стало известно более 300 лет назад: в 1675 году, используя ручной световой (оптический) микроскоп, Антони ван Левенгук (1632–1723) впервые смог увидеть одноклеточные организмы и назвал их «маленькими животными». Позднее основоположники современной микробиологии — Луи Пастер (1822–1895), Фердинанд Кон (1828–1898) и Роберт Кох (1843–1910) — своими исследованиями подтвердили сложность микробного мира. А «маленькие животные» ван Левенгука через 150 лет получили название микроорганизмов11. Вновь открытый мир одноклеточных (как до этого — растений и животных) нужно было систематизировать, а для этого подробно изучить.

С конца 1800-х годов «золотым стандартом» для идентификации и характеристики микробов стало выделение и культивирование бактерий на питательных средах с дальнейшим изучением свойств колоний. Библиотека открываемых видов постоянно пополнялась, однако большое число сравниваемых фенотипических признаков и равная их значимость затрудняли классификацию бактерий. Нюансы строения бактериальных клеток мешали при их изучении применять методы, с успехом используемые в ботанике или зоологии на протяжении веков. В частности, описательные технологии (цитоморфологический метод) оказались непригодны: бактерии довольно просто устроены, у них нет типичного ядра и других органелл, а также отсутствует половой процесс.

Лишь в XX веке появилась возможность изучать микроорганизмы по очень важному функциональному признаку — их ферментативной активности. Ферментативный спектр — это таксономический признак, характерный для семейства, рода и — в некоторых случаях — для вида. Поэтому и сейчас для установления систематического положения бактерий с помощью специальных тест-систем определяют спектр вырабатываемых ими ферментов. Однако с идентификацией огромного количества видов, сведения о которых накопились к концу столетия, не смог справиться и ферментный метод.

Открытие группой учёных в конце 80-х годов прошлого столетия12,13 полимеразной цепной реакции (ПЦР) дало возможность взглянуть на бактериальную клетку «изнутри». В процессе ПЦР накапливают (амплифицируют) ДНКматериал, выделенный из бактериального образца, что позволяет проводить геномную идентификацию и анализ микробных сообществ. За разработку метода амплификации Фредерик Сэнгер (Frederick Sanger) в 1980 году получил Нобелевскую премию по химии.

Методы определения последовательности нуклеотидов ДНК развивались по пути уменьшения затрат и увеличения точности. В настоящее время многие исследователи в этой области полагаются на платформу секвенирования, разработанную в 2000 году Джонатаном Ротбергом (в производство запущена в 2005 году). На сегодня это наиболее удобный, дешёвый и быстрый анализ образцов ДНК и РНК.

Секвенирование микробного генома с применением методик нового поколения коренным образом меняет наше представление о микробном разнообразии; эта технология оказала огромное влияние на расшифровку отдельных микробных геномов. В 1995 году гемофильная палочка Haemophilus influenzae стала первой в исследовании бактериального генома14. Размер генома составил 1,8 Мб, что в 10 раз больше ранее исследованных последовательностей. Воссоздание этого генома по методу Сэнгера потребовало бы более 3 мес и задействования 14 машин, а технология секвенирования Next Generation позволяет затратить 1 нед и использовать только одну машину. Во время вспышки, вызванной E. coli в Германии в мае– июне 2011 года и охватившей почти все регионы страны, использование для секвенирования диагностической платформы Ion Torrent Personal Genome Machine позволило почти сразу идентифицировать возбудителя (серовар О104:Н4) и ликвидировать вспышку в течение 3 дней15.

Однако и секвенирование — уже не на вершине генетических методов исследования. Дело в том, что существуют определённые трудности изучения некультивируемых микроорганизмов, связанные с малым количеством их геномного материала. В этих случаях применяют «топовый» из современных микробиологических исследований метод — метагеномику. Это раздел молекулярной генетики, изучающий генетический материал, получаемый напрямую из образцов среды (метагеном, а не отдельно взятых бактерий и других клеток). Традиционное секвенирование геномов полагается на культивируемые клоны культур, в то время как метагеномика работает с набором всех ДНК, находящихся в среде. Основное отличие при использовании метагеномного подхода — учёт некультивируемых микроорганизмов наряду с культивируемыми.

Примером метагеномного анализа служит исследование микробной биомассы, проведённое в различных водных скважинах, рудниковых водах, активном иле, горячих источниках, а также в верхних слоях Саргассова моря16–19. Помимо хорошо известных бактерий и фагов исследователи обнаружили и представителей недавно установленных филумов, и совсем новые бактерии20,21. Кстати, аналогичным образом была в своё время открыта Atopobium vaginae — без генетических методов отличить её от вагинальных лактобактерий не получалось.

Одной из основных целей 5-летнего проекта «Микробиом человека» было определение «карты микробного разнообразия» на нескольких участках тела здорового взрослого человека в большой когорте обследуемых (n=242)22. В перечень исследуемых локусов вошли ротовая и носовая полости, желудочно-кишечный тракт, кожа, а также влагалище у женщин. Из клинических образцов, взятых на этих участках, были проанализированы метагеномные данные, включая описание 16s рРНК (см. врез «Родственники? Покажет 16s РНК!»). Исследование подтвердило, что каждая область тела содержит доминирующий вид бактерий23–26: например, в сальных областях за ухом позади ушной складки преобладают липофильные Propionibacterium, в кишечнике — Bacteroidetes и Firmicutes, во влагалище — Lactobacillus.

Что касается вагинального биотопа, то и здесь было немало нового. Как известно, лактобактерии образуют молочную кислоту из гликогена для создания кислой среды влагалища динамически и это защищает женщину от инвазии новых и чрезмерной активности транзиторных патологических микроорганизмов. Обнаружена чёткая корреляция между уровнем рН влагалищной среды и числом лактобактерий в локальном микробиоме: чем выше кислотность, тем меньше доля вырабатывающих кислоту микроорганизмов, и, наоборот, при повышении рН число лактобактерий компенсаторно увеличивается28. Таким образом, состав вагинальной микрофлоры у женщин может динамически меняться в широких пределах нормы.

Учёные из университетов штата Мэриленд и штата Айдахо на протяжении 16 нед наблюдали за состоянием вагинального микробиома 32 здоровых женщин репродуктивного возраста. Наблюдения показали, что существует пять основных классов бактериальных сообществ. В четырёх из них преобладают лактобактерии (L. iners, L. crispatus, L. gasseri или L. jensenii), ещё в одном — облигатные анаэробы. Качественный и количественный состав каждого класса может меняться в течение короткого периода или оставаться относительно стабильным на протяжении длительного времени. Иногда он зависит от менструального цикла женщины, а иногда — нет. Все происходящие в микробиоме перемены очень индивидуальны. Однако эти совокупные данные позволили сделать важнейший вывод о динамичности вагинального биотопа «…Сейчас состояние женщины оценивают по одной пробе, но на самом деле это неправильно, — считает глава проекта Жак Равель (Jeaques Ravel). — Повторные исследования вагинального микробиома в течение некоторого времени позволят снизить частоту гипердиагностики и ненужное назначение антибиотиков широкого спектра действия»29. Более ранние исследования показали, что состояние влагалищной микрофлоры зависит, в частности, от этнических характеристик. Это связано с разным уровнем кислотности во влагалищной среде: он ниже у латиноамериканок (pH 5,0) и африканок (pH 4,7) по сравнению с женщинами европейского (pH 4,2) и азиатского (pH 4,4) типов. Соответственно, латиноамериканки и чернокожие женщины хуже защищены от проникновения патогенной микрофлоры и чаще страдают бактериальным вагинозом26,28 — с этой проблемой сталкивается от 25 до 30% всех женщин (самая частая причина посещения гинеколога).

«…Если нам удалось бы выявить женщин с высоким риском бактериального вагиноза, мы могли бы предложить им меры по профилактике заболевания», — объясняет соавтор исследования, доктор Ларри Форни (Larry Forney). Учёные не рассчитывают, что гинекологи немедленно пересмотрят принципы лечения своих пациенток, однако они надеются на индивидуальный подход к лечению женщин в будущем.

Первое в истории исследование кишечного микробиома во время беременности провела группа учёных из университета Корнелл (Итака, штат Нью-Йорк) под руководством Рут Лей (Ruth Ley). Выяснилось, что в период гестации, особенно в III триместре, кишечный микробиом женщины уподобляется таковому у пациентов с риском сахарного диабета. Эти перемены не могут быть расценены как нарушение здоровья будущей матери, но соотносятся с повышением содержания глюкозы в крови и накоплением жировой клетчатки для питания плода.

Ранее Рут Лей исследовала микробиом у пациентов с метаболическим синдромом — известным предвестником сахарного диабета, для которого также характерны повышение уровня маркеров воспаления, гипергликемия и ожирение. Проведя секвенирование микробной ДНК из образцов кала, взятых в ранние и поздние сроки беременности, она обнаружила, что в микробных сообществах происходят фиксированные изменения. В целом степень разнообразия в кишечном микробиоме к III триместру снижается, но возрастает количество протеобактерий и актинобактерий. То же самое происходит у людей тучных или страдающих метаболическим синдромом. Коллега Рут Лей, Кьёрсти Аагаард (Kjersti Aagaard), считает, что в этом сходстве есть определённый смысл, поскольку в это время плод активно набирает массу тела, а в организме матери максимальны энергетические запасы, накопленные для успешной лактации30. Однако биологическую целесообразность и медицинские перспективы обнаруженной аналогии ещё предстоит осмыслить.

Как немыслима здоровая репродуктивная система без нормальной влагалищной микрофлоры, так и полноценное лечение невозможно без детального понимания того, как устроен и функционирует микробиом человека. Микробиология и медицина выходят на новый уровень понимания происходящего в системе «организм человека и населяющие его микроорганизмы», и от перспектив этого нового знания захватывает дух. В любом случае передний край науки в наши дни проходит очень близко к практической медицине: сегодняшние теории на наших глазах превращаются в завтрашние методы диагностики и лечения заболеваний.

Источник: elibrary.ru (Авторы: Игорь Николаевич Костин, докт. мед. наук, проф. кафедры акушерства и гинекологии с курсом перинатологии РУДН; Людмила Юрьевна Куванкина, StatusPraesens, Хильда Юрьевна Симоновская, StatusPraesens (Москва)